浙江省微生物所发布2017年度菌种鉴定分析报告

2017年我所接收鉴定样品中，细菌占比89.5%，真菌占比10.5%。尽管真菌占比与去年发布的报告相比下降5个百分点（微生物研究所发布2016年前三季度菌种鉴定分析报告），但我们分析认为在洁净区的环境监控中真菌仍没有如此高的占例，其中的原因更有可能是因为面对未知真菌，企业基本上没有能力自行鉴定，因而选择送到到我单位有关。

从总体趋势来看，除受2月份春节和10月份的小长假影响之外，全年送样量呈现稳步上升的趋势（见下图1）。

从细菌和真菌的相对比例中看，整体趋势在3月开始，整年都基本趋于稳定（见下图2 ）。通常认为的梅雨季节可能出现的真菌爆发的情况，在我们的数据分析中并没有反映出，这可能与企业对洁净区管控意识加强和主动防御有关，这是值得欣慰的事情。

按送样企业所属地区进行分析，发现不同区域检出物种情况各有不同，但整体上仍以葡萄球菌属，芽孢菌属和微球菌属为主要菌属。物种结构相似的地区除了采样均衡之外，也与气候等因素相关（见下图3）

图3可见浙江省与上海市由于地区自然气候、送样量等都相近的原因，整体的菌群结构类似；

江苏省的芽孢杆菌属含量相对较高，这是由于17年6~7月份，我们集中收到江苏省多家制药企芽孢杆菌属爆发的信息，这两个月检出芽孢杆菌属数量占到当月50%以上；

四川（含重庆市）、北京的物种从图表上看相对单一，可能与这些省份相对送样量较少有关；

而东三省以及广东地区“其他”比例偏高，这是因为该地区企业送样多以零散为主。

通过我们的数据分析显示，全年出现频率在100次以上的物种只占到全部鉴定到的种水平的1%，而全年出现频率小于5次的物种，占到全部鉴定到种水平的73%（见下图4）。

低频检出的种类通常认为是偶发的因素造成，比如环境的微小变化，物料批次的偶然改变等，也可能是因为我们收样数量和区域的快速增长和拓展，造成区域与送样量的不均匀。

而频次高的检出菌主要为人体皮肤上的微生物，例如葡萄球菌属、微球菌属等按表型归类为革兰氏阳性球菌的类群（见后图5），由于人体是最大的污染来源，所以这是最为普遍和正常的现象。

从全年细菌优势菌种统计数据来看，比例超过1%的种中，藤黄微球菌、表皮葡萄球菌、科氏葡萄球菌、人葡萄球菌分别排在第一到第四（见下图6）。

图6 2017细菌优势菌种统计（检出率1%以上）

人体皮肤上的微生物为洁净区最主要的微生物源，毕竟几乎所有的区域都有人的活动，这也是上文提到按区域划分时，主要检出菌具有共性的原因之一。因此规范进入洁净区的人员操作和清洁程序，如更衣、手套清洁、耳鼻防护和防止衣物纤维掉落等，将有助于减少人源携带导致的微生物污染。

洁净区中绝大多数的细菌为嗜中温需氧或兼性好氧细菌，除革兰氏阳性球菌，主要检出菌为【革兰氏阴性好氧或者微好氧杆菌或者球菌】和【革兰氏阳性产孢杆菌或球菌】（图5）。【革兰氏阴性好氧或者微好氧杆菌或者球菌】以鞘氨醇单胞菌属、假单胞菌属、罗尔斯通氏菌属等水中常见属为代表，这些菌与管道生物膜形成相关，在夏季高温之后呈现一定的上浮，如不处理，可能会形成持续的污染源并不间断爆发而造成水系统超标，企业需要结合实际情况进行消杀与管控。

【革兰氏阳性产孢杆菌或球菌】以芽孢杆菌属为最主要代表。芽孢杆菌属几乎无处不在，在胁迫环境下，其可以产生芽孢，通常这些芽孢能耐受干燥的环境，有些还能耐受较高温度等各种恶劣条件，细菌借此形态保持很长时间的休眠状态，并在条件适宜时萌发，恢复营养体的状态，造成污染爆发。而普通灭菌方法，如酒精、紫外等对芽孢无效，消杀时可考虑针对芽孢的消杀方法。

非水环境的采样中，微生物组成以革兰氏阳性菌为主，偶尔出现的少量革兰氏阴性菌，预示着地面、表面可能存在潮湿区域或者角落。此外，更衣室或相关人员(如咳嗽或打喷嚏)卫生问题也可能造成一定的引入（如莫拉氏菌属）。

真菌主要检出菌属为曲霉属和青霉属（具体见图8），两种常见的霉菌总和占到鉴定到所有真菌的40%。这两种真菌均能产生孢子，能在室内空气和灰尘中甚至天花板的侧面板上存活。当此类物种检出数量增加时，需要考虑洁净区空气过滤器以及气流通风口，及时清洁与更换。除了空气中，物品的传入与传出（如纸张）也会携带各种孢子，需要格外关注，总体来说霉菌的生长需要一定的湿度，因此，在霉菌高频出现区域需注意控制湿度。

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不同维度分析与讨论

 

3.1 部分菌属和气候因素相关

湿度对于霉菌的生长繁殖是至关重要的，温度，湿度过低，霉菌的繁殖会受到抑制，空气湿度提升对于霉菌的生长呈现一定的促进作用。从浙江省内每月霉菌检出比例与2017年浙江省平均湿度关联可见，霉菌检出比例与浙江省2017年湿度的变化呈现相近的趋势（图9）。4月与8月，湿度降低的月份，霉菌检出比例有明显的降低，5月开始，随着空气湿度的增加，霉菌检出比例也呈现上升的趋势（1、2月份的送样量不均，不做参考）。

 

 

 

有意思的现象是，不止霉菌和湿度相关，我们发现，部分类型的细菌和湿度也呈现相关性。从形态上分，2017年浙江省受检革兰氏阳性产孢杆菌或球菌与湿度呈现了和霉菌类似的相关性（图10）。虽然洁净区对湿度有一定的控制，洁净区革兰氏阳性产孢杆菌或球菌检出趋势依然与湿度变化呈正比，该类群的检出和表面消毒不彻底及污染的物料有关，对天气湿度增加的月份，尤其需要注意对物料与材料的消毒，增强芽孢的消杀与防控。

在制药行业的送样中，从部分具有代表性的生物制药企业、中药制剂企业和化药生产企业检出细菌进行比较，整体来说，三类企业的鉴定结果中优势菌属一致，即葡萄球菌属、芽孢杆菌属和微球菌属，再次表明这几个菌属的检出受地域，企业类型的因素影响较小。检出结果中，革兰氏阳性菌在中药制剂企业中比较占优势，包括葡萄球菌属、芽孢杆菌属、微球菌属、克氏库克菌属、类芽孢杆菌属等，而革兰氏阴性菌在化药生产企业中占优势，包括鞘氨醇单胞菌属、罗尔斯通氏菌属、寡氧单胞菌属等，而生物制药企业的结果处于两者之间。不同类型的企业，洁净区的微生物特征明显，从图11可知，化药生产企业更需要考虑水体微生物污染，而中药制剂企业则更偏向于环境和空气进行预防与消杀。

 

 

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后记

在撰写报告的过程中，我们与跟我们合作的部分企业进行了沟通和比较，通过企业的反馈，我们得出的结论：

1、分析结果与企业真实情况的相似程度，很大程度上取决于送样的频率和数量的稳定性。送样均衡性和稳定性好的企业，分析结果与实际情况越吻合；
2、历年数据对环境菌控制的指导意义：①部分企业历年与当年数据变动不大（如化药企业D），表明其环境菌基本处于稳定状态，这是环境数据库的分析结果可以为企业来年的环境菌控制提供良好的数据支撑；②部分企业历年数据与当年数据差异较大的（排除了送样频率和数量的变动较大的企业），表明该企业在生产环境的环境菌控制方面可能仍然存在未被控制的因素（比如新增或是扩大采样范围等），导致环境菌的变化未能达到预期的稳定状态。我们的分析结果有助于他们将这些未受控的因素纳入控制。

 

 

分析花絮

 

1、对比2016年数据，我们发现Geobacillus stearothermophilus（嗜热嗜脂肪地芽孢）和Bacillus atrophaeus （萎缩芽孢杆菌）的鉴定量明显增加，且在加急请求中排名靠前。由于这类菌一般被用做生产指示剂的菌株，因而推测可能的原因是很多企业是在做指示剂的验收，以及可能发生的指示剂……污染调查。

2、我们梳理了2017年收样中有加急鉴定需求的项目结果，真菌类、假单胞菌属等排名前列。分析其原因之一可能是因为真菌类和部分水系统菌落企业自行鉴定能力和手段较薄弱（前文在对真菌总含量偏高已有表述），原因之二也说明水系统的监测超标可能是很多企业的共性问题，这点提醒相关企业注意防范。

3、除了对菌种的保守片段进行测序鉴定外，2017年我们还帮助部分企业在其关键的区域溯源调查中使用到全基因组测序鉴定。虽然我们认为在洁净区的鉴定溯源上对保守片段的基因测序加生化相关指标已经满足初步需求（再次强调前提是受控环境中，可讨论），但基于全基因组的测序无疑是最精确、最具有说服力的，我们也乐见企业有此种意识。

4、很多企业送样标准菌株鉴定时，我们被经常问到关于CMCC和ATCC菌株的等效问题，也帮助企业从基因片段的角度做过序列比对，结果显示有部分完全相同，也有部分有少量碱基之差。至于是否可以等效，或者可以选其一做为代表，我们认为这应该由法规的制定部门来解释，我们只是从纯鉴定的技术角度并不能足以回答相关问题。

晚些时候我们可能会发布从全基因组测序的角度分析相关菌株的数据，以便内业探讨，请保持关注。

5、在企业送样的培养基上，我们非常直观的感受是同2016年相比，2017年成品培养基基本已占绝对主导地位，由此可见成品培养基越来越被企业微生物人员青睐，该产品的总体市场规模处于高增长。另外我们从方便收样、防止运输不破损的角度可能也对成品培养基做了一点点的推动工作，尽管到现在也没有哪家企业付点推广费什么的^-^。